ELISA的基本原理

ELISA是指以酶作為標記物、以抗原和抗體之間免疫結(jié)合反應為基礎(chǔ)的固相吸附測定方法。因此，一個ELISA測定試劑，其有機組成部分包括：（1）包被的抗原或抗體的固相支持物，即聚苯乙烯塑料微孔或試管；（2）酶標記的抗體或抗原和（3）酶的反應底物等?？乖蚩贵w的固相化，并不影響其免疫結(jié)合活性，酶標記的抗體或抗原亦是如此，并且標記酶的活性不因標記過程而喪失。整個測定中，抗原與抗體的結(jié)合反應在固相支持物上進行，反應結(jié)果的判斷，以酶與其底物作用后的顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光反應為標準，顯色或產(chǎn)生熒光或發(fā)光的強度，與臨床標本中待測物的濃度成正比或反比關(guān)系。目前國內(nèi)的ELISA試劑盒均以酶的顯色反應來完成測定。

二、固相上抗原抗體相互作用的免疫化學[2,3]

   通常所提到的抗原與抗體的相互作用，一般指的是在液相狀態(tài)下，而在固相狀態(tài)下，抗原與抗體的結(jié)合反應有其相應的特點，主要表現(xiàn)在以下四個方面。

（一）固相上抗原與抗體結(jié)合反應所需要的時間較液相狀態(tài)下長

通常，固相免疫測定如ELISA中，抗原與抗體結(jié)合達到平衡所需要的時間，較液相免疫測定要長，并隨液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比的增加而增加。當在微孔板孔內(nèi)進行免疫測定時，界面反應動力學顯示其對擴散作用有很強的依賴性，擴散性越強，則反應所需時間越短，結(jié)合越充分。這一點可通過旋轉(zhuǎn)振蕩來達到，微孔的旋轉(zhuǎn)振蕩可促使液體進入到可與抗體或抗原包被的界面接觸的較小的區(qū)域內(nèi)。也可在微孔中放一個惰性的塞子以使反應液體成為一個小體積，或使用一個具有大表面的多孔的基質(zhì)如硝酸纖維素，或使用微顆粒來做到這一點。微顆粒小于1μm時，在測定時即成膠體懸液，而當顆?；蛑檩^大時，則會在沒有振蕩時，由于重力的作用而分開。所有上述方法均是通過減少液體所占體積與界面抗體或抗原受體所占體積比，從而減少固相免疫測定的擴散依賴性。

（二）固相上抗原與抗體接觸表面的反應體積遠小于液相測定

此處的反應體積并非是微孔中的液體體積，而是固相免疫測定中與固相包被的抗體或抗原有接觸的部分，這部分體積到底有多少，很難測定，但比反應管中總液體體積要少得多。固相抗原抗體反應發(fā)生于液體-固相界面，可能處于一級結(jié)合鍵的引力距離內(nèi)，小于100Å。液相中待測抗原或抗體要進入到這個結(jié)合界面，需要經(jīng)過擴散或質(zhì)量轉(zhuǎn)移。微顆粒的反應表面區(qū)域較微孔要大得多，因而處于抗原抗體結(jié)合界面的體積占總反應體積的比例亦高得多。因此，結(jié)合反應的效率更高。這也是全自動化免疫測定分析儀均采用微顆粒固相的重要原因之一?？蓞⑴c結(jié)合反應的抗體或抗原的濃度取決于可參與結(jié)合的反應體積，無法計算這種反應體積，從而難以使用通常的質(zhì)量作用定律圖形來計算Keq。因此，固相上抗原與抗體反應的Keq值與液相抗原與抗體反應的Keq值沒有可比性。

（三）固相上抗原和抗體間結(jié)合后的離解速率較液相測定低

固相免疫測定中固相表面上抗原和抗體間的相互作用，類似于細胞表面上蛋白與其受體間的結(jié)合。研究表明，細胞表面上的蛋白與受體結(jié)合反應的離解速率較液相中的要低兩個梯度，同樣，固相免疫測定中，固相上抗原和抗體的離解速率亦同樣緩慢，其基本原理相似，概述如下：（1）細胞表面上蛋白與其受體的相互作用涉及到細胞表面受體的聚集，由于多價復合物離解的減少，相應地親合力增加。研究表明，被動吸附于固相的抗原和抗體也是成簇或聚集狀的，因此，反應界面的抗原或抗體可能也是“成簇的”。（2）大多數(shù)抗原-抗體的離解所需的能量比防止其結(jié)合所需的能量要大，表明在初始結(jié)合鍵形成后，又形成了次級結(jié)合鍵。這提示在固相免疫測定和其它細胞表面反應中，形成了大量的次級結(jié)合鍵。（3）以成簇出現(xiàn)的和來自于限定的界面反應體積內(nèi)的抗體或抗原，常以很高的濃度存在，這種情況下，即使抗原和抗體有離解發(fā)生，離解的抗原的重新結(jié)合也較液相系統(tǒng)更為快速。這可以解釋為何固相免疫測定與液相測定相比時，其抗體的Keq較高。正是這種極緩慢的離解速率，使得ELISA和固相免疫測定技術(shù)具有很好的適用性，即使是測定的反復洗滌步驟，也可使受體配體的相互作用仍保持處于結(jié)合狀態(tài)。

（四）微孔內(nèi)特異抗體免疫測定的親和力依賴性

使用固相包被的復雜抗原進行微孔內(nèi)特異抗體的免疫測定，與液相測定相比，有明顯的親和力依賴性，固相受體-配體相互作用的穩(wěn)定性，似乎與微孔內(nèi)特異抗體的免疫測定親和力依賴性和極低比例的所捕獲的總抗體相矛盾，這可能是因為：（1）在所吸附于固相的復雜抗原中，能與液體中特異抗體結(jié)合的抗原濃度極低。這可能是由于所吸附的抗原因為變性或空間位阻而致抗原表位喪失的結(jié)果。（2）抗原表位由于固相吸附發(fā)生改變，使得特異抗體與其結(jié)合的親和力較低。當抗原以1~5 g/ml濃度被動吸附于固相時，大多數(shù)蛋白抗原的60-80%至少會以一個單層而穩(wěn)定的吸附于固相，這樣在固相上的總的抗原就不會缺乏。如果500-800m ng抗原穩(wěn)定的吸附于微孔板孔，對含500 g/ml抗體的血清的1：10,000稀釋可提供大于10倍過量的抗原，考慮到抗原和抗體間相互作用的合理的Keq，只是從吸附抗原的量的有限性，不能解釋固相上抗原與抗體結(jié)合的低親和力，而更可能是由于空間位阻或吸附引起的變性所致的抗原表位的喪失所致。m

（五）固相的抗體或抗原與液相中的抗體或抗原在構(gòu)型上不一樣

固相化的抗體或抗原可能與液相中的抗體或抗原所展示的構(gòu)型不一樣，對抗體或抗原由于固相化尤其是被動吸附或其它吸附方式所致的構(gòu)型改變已有眾多的文獻報道。本書的另一章節(jié)將有專門介紹。

三、臨床ELISA測定的常用模式

  ELISA依其測定抗原和抗體的不同，測定模式有很多，如直接法、間接法、雙抗體夾心法（直接、間接）、競爭抑制法（直接、夾心等）、捕獲法等[4]。在臨床實驗室，常用的ELISA測定模式有雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、競爭抑制法和捕獲法等。在抗原的測定上，蛋白大分子抗原測定用的zui多的模式是雙抗體夾心法，而對只有單個抗原表位的小分子，則使用競爭抑制法；抗體的測定通常使用間接法、雙抗原夾心法、競爭抑制法和捕獲法等。

   （一）抗原測定ELISA模式

    1. 雙抗體夾心法    對于含多個抗原表位的大分子蛋白，使用雙抗體夾心ELISA模式測定相當簡便，現(xiàn)有的測蛋白抗原的商品試劑盒基本上都采用此種測定模式。具體測定方法如下。

   （1）首先以雙抗體之一于碳酸鹽緩沖液中2~8℃下一夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗體后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明膠等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
   （2）加入含待測物的臨床樣本如血清（漿）等，溫育（通常為37℃下）一定時間后，洗板；此時，待測抗原就會與固相上特異抗體結(jié)合而吸附于固相上。
   （3）加入酶標記的雙抗體之二，溫育（通常為37℃下）一定時間后，洗板；此時，在固相上即形成雙抗體與特異抗原的夾心產(chǎn)物。
    (4) 加入酶底物，溫育（通常為37℃下）顯色測定。

     我們曾使用本室能得到的含zui高濃度（約2,000,000 ng/ml）HBsAg的血清樣本，對國內(nèi)較大的試劑生產(chǎn)廠家的“一步法” HBsAg測定ELISA試劑盒的“鉤狀效應”進行了評價，盡管大部分試劑在HBsAgzui高濃度下的測定顯色較次高濃度（1:10稀釋）顯色要淺，在曲線上出現(xiàn)了“鉤狀”，但均未出現(xiàn)該份樣本測定為陰性的情況。盡管如此，在臨床實驗室實際工作中，仍有可能遇到“鉤狀效應”較嚴重的HBsAg測定ELISA試劑盒，基層實驗室同行也有這方面的反映。因此，還應該重視“一步法”試劑盒所致的假陰性問題，當發(fā)現(xiàn)測定結(jié)果明顯與臨床不符或與相關(guān)測定指標互有矛盾，如HBeAg陽性樣本HBsAg測定為陰性時，就應考慮HBsAg測定可能存在的“鉤狀效應”所致假陰性問題。

 

    綜上所述，一步法ELISA試劑盒作為迎合臨床實驗室簡便快速要求的產(chǎn)物，有著巨大的市場，其雖有潛在缺陷，易導致含高濃度待測物的標本檢測為陰性（假陰性），但精心的實驗設計，對包被和酶標記抗體仔細選擇，*可以將“鉤狀效應”出現(xiàn)的可能性降至zui低。此外，建議生產(chǎn)HBsAg、αFP、前列腺特異抗原（PSA）、CA系列標志、hCG及激素等“一步法”免疫測定試劑盒的廠家，應對所產(chǎn)的試劑在出廠前對其“鉤狀效應”進行充分的研究，并提醒用戶在使用時應注意之處。

    雙抗體夾心法測抗原另一個所需要注意的是類風濕因子（RF）和補體等的干擾。我們知道，RF是一種抗變性IgG的自身抗體，主要為19S的IgM類，也可見7S的IgG及IgA。這種自身抗體的特性是其是能多種動物的變性IgG的Fc部份結(jié)合。因此，如果血清標本中含有RF，在雙抗夾心ELISA檢測時，其即可作為固相抗體和酶標抗體（均為IgG）之間的橋接抗原，而產(chǎn)生假陽性反應。同樣，抗體也有補體C1q的結(jié)合位點，同樣會造成類似于RF的測定干擾。

    2. 競爭法  大分子抗原因其具有兩個以上的抗原表位，而可用雙抗體夾心法測定，小分子半抗原如茶堿等藥物以及T3、T4、睪酮等激素，因其可能只有一個抗原表位，或因為分子太小，結(jié)合一個抗體后，因空間位阻，無法再結(jié)合另一個抗體，所以不能使用雙抗體夾心方法測定，只能采用競爭抑制法。具體步驟如下。
（1） 先用抗小分子的特異抗體如雙抗體夾心法一樣包被固相并封閉。
（2）同時加入待測樣本和酶標的小分子，溫育一定時間后，洗板；此步中，待測樣本中的小分子將與酶標小分子競爭與固相上特異抗體結(jié)合。
（3）加入酶底物，溫育，顯色測定，顯色的強弱與待測樣本中的小分子含量成反比。

這種測定模式中，需要得到小分子與酶的結(jié)合物，而小分子酶結(jié)合物，一則在制備上不如抗體酶結(jié)合物簡便，二則其純化亦頗為困難，結(jié)合有小分子的酶與游離酶之間分子量區(qū)別小，使用一般的分子篩方法難于分離。因此，有人嘗試在合成二或多聚體小分子的基礎(chǔ)上，建立雙抗體夾心競爭ELISA方法測定小分子，測定的靈敏度和特異性均有所提高。

（二）抗體測定模式

1.間接法    測定機體針對感染性疾病病原體抗原所產(chǎn)生的抗體，在難以得到高純度且特性明確的抗原以前，或抗原較為復雜的情況下，一般均使用間接法，其基本操作步驟如下。

   （1）將特異抗原在碳酸鹽緩沖液中2~8℃一夜包被，形成固相抗原，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
   （2）加入含待測抗體的臨床樣本如血清等，溫育（通常為37℃下）一定時間后，洗板。此時，待測抗體就會與固相上特異抗原反應而吸附于固相上。
   （3）加入酶標記的抗人IgG抗體，溫育（通常為37℃下）一定時間后，洗板；此時，在固相上即形成固相抗原－待測抗體－酶標二抗復合物。
  (4) 加入酶底物，溫育顯色測定。

現(xiàn)在臨床常用的檢驗項目丙型肝炎病毒抗體（抗-HCV）的測定均為間接法模式，以前人免疫缺陷病毒抗體（抗-HIV）以及梅毒螺旋體抗體等的測定也曾使用過間接法。從上述的測定模式可見，間接法測抗體，嚴格地講，所測定的僅為抗體的IgG類，不涉及IgM和IgA類，這是由酶標二抗體所決定的。當然，如果酶標二抗為羊抗人IgM或IgA，則也可以采用間接法測定特異的IgM和IgA類抗體，目前有些特異的IgM類抗體檢測試劑盒即是采用間接法模式。
 

影響間接法測定抗體的一個較大的因素是包被抗原的純度。以前使用從細胞培養(yǎng)得到的病毒裂解后，純化得到的抗原，由于抗原較為復雜，且難于*除去培養(yǎng)細胞所含的主要組織相容性抗原，以此種抗原建立的間接法測定特異抗體，有可能存在較高假陽性?，F(xiàn)在間接法測抗體中所使用的抗原一般均為基因工程重組抗原，如HCV的NS3、NS4、NS5，HIV的gp41、gp120和gp160，以及梅毒螺旋體TpN15、TpN17、TpN47等?；蚬こ炭乖诩兓瘯r，應盡量去除用來表達的細菌如大腸桿菌的抗原，以免由于機體存在對這種細菌的抗原的抗體，而引起假陽性反應。此外，由于機體的IgG類抗體濃度較高，其中絕大部份為機體接觸外界環(huán)境刺激所產(chǎn)生的非特異IgG，因此，為避免這些高濃度非特異IgG對固相的吸附所致的假陽性反應，通常需對待測樣本作一定程度的稀釋，但由于臨床實際工作中，如有標本稀釋步驟，實驗操作者會覺得太麻煩，故通常試劑廠家采取在板孔中先加稀釋液，再加入標本的稀釋策略。此時，標本的加入量較通常的雙抗原夾心法要少很多，如10 µl。

在使用間接法測IgM抗體時，由于臨床血清樣本中含有高濃度的IgG抗體，其中部分特異IgG抗體將與IgM抗體競爭與固相抗原結(jié)合，從而干擾IgM抗體的檢測。因此，在使用間接法測定IgM抗體時，通常須將血清樣本用抗人IgG抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA）預處理，以去除IgG的干擾。這樣不但測定較為繁瑣，而且影響測定的特異性和靈敏度。

2.雙抗原夾心法    前面提到，間接法測抗體依所使用的二抗的種類，實際上測定的可能只有IgG或IgM或IgA類。 而雙抗原夾心法所測定的抗體，則包括所有各類特異抗體，且不受非特異IgG的干擾，因此，雙抗原夾心法測抗體的靈敏度和特異性要高于間接法。目前，為提高抗體測定的靈敏度，國內(nèi)的間接法ELISA試劑盒，除抗HCV因其抗原較為復雜外，已基本采用雙抗原夾心法檢測模式。

雙抗原夾心法測抗體的模式類似于雙抗體夾心法測抗原，其操作步驟亦基本相同，也可采用類似于雙抗體夾心法測抗原模式的“一步法”，如果在急性感染狀態(tài)下，機體產(chǎn)生抗體IgG的滴度通常不高，不會出現(xiàn)明顯的“鉤狀效應”，但如果為慢性感染，在抗體滴度很高的情況下，也會存在“鉤狀效應”，如抗-HIV和梅毒抗體測定的“一步法”雙抗原夾心ELISA試劑盒，就可能出現(xiàn)上述“鉤狀效應”，造成漏檢。此外，為了保證測定的靈敏度和特異性，酶標用抗原應仔細加以選擇。

3.競爭法    抗體的測定一般不使用競爭法。當抗原中雜質(zhì)難以去除或抗原的結(jié)合特異性不穩(wěn)定時，可采用這種模式測定抗體，zui典型的例子是乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗體（HBeAb）的測定。由于e抗原較核心抗原僅多29個氨基酸，e抗原很容易轉(zhuǎn)變?yōu)楹诵目乖?，因此，HBcAb和HBeAb的測定均采用競爭法。但其測定具體模式有區(qū)別?？乖墓滔嗷贖BcAb的測定，乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）直接包被于固相上，而在HBeAb測定，則先將特異抗e抗原的抗體包被于固相上，在測定時，再將e抗原通過相應特異抗體而間接固相化。

HBcAb和HBeAb ELISA測定具體操作步驟分述如下。

HBcAb的競爭法測定：

（1）先將HBcAg在碳酸鹽緩沖液中2~8℃一夜包被，形成固相抗原，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明膠等封閉，洗滌，去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
（2）同時加入待測樣本和酶標的特異抗體，溫育（通常為37℃下）一定時間后，洗板。此步中，待測樣本中的抗體將與酶標抗體競爭與固相上特異抗原結(jié)合。
（3）加入酶底物，溫育顯色測定，顯色的強弱與待測樣本中的相應抗體的含量成反比。

     HBeAb的競爭法測定：

    （1）先將HBeAb在碳酸鹽緩沖液中2~8℃一夜包被，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗原后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明膠等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
（2）同時加入待測樣本和中和抗原HBeAg，溫育（通常為37℃下）一定時間后洗板；此步中，待測樣本中的抗體將與固相抗體競爭與中和抗原結(jié)合HBeAg，待測樣本中HBeAb濃度越高，則與固相HBeAb結(jié)合的HBeAg越少，反之亦然。
（3）加入酶標的特異抗體，溫育一定時間后洗板；此步中，酶標抗體將與結(jié)合于固相抗體上的特異抗原結(jié)合；
（4）加入酶底物，溫育顯色測定，顯色的強弱與待測樣本中的相應抗體的含量成反比。
現(xiàn)試劑盒通常將第（2）和第（3）步并為一步，先后加入樣本、酶標抗體和HBeAg，此時，固相抗體、酶標抗體和樣本中的特異抗體將一起競爭與加入的HBeAg結(jié)合。這樣更能體現(xiàn)競爭測定的實質(zhì)。
    HBeAb之所以要采用此種模式測定，主要是HBeAg的不穩(wěn)定所致，如在固相直接包被HBeAg，則會因為HBeAg向HBcAg的易轉(zhuǎn)變性，而導致測定誤差。
抗體的競爭法測定不同于只有單個抗原表位的小分子抗原的競爭法測定，其測定的可靠性，在很大程度上，受競爭抗體的特異性和親和力大小的影響，競爭抗體與待測抗體在結(jié)合的特異性及親和力越接近一致，則測定的可靠性越強，但競爭用抗體均為相應抗原免疫動物所得，與機體感染病毒后所產(chǎn)生的抗體肯定會有所差異，因而在目前HBeAb和HBcAb的臨床檢測中，常有難以解釋的測定結(jié)果出現(xiàn)，這與其在方法學上的固有缺陷是分不開的。

    4.固相捕獲法     在病原體急性感染的診斷中，通常需檢測IgM抗體，如急性甲型肝炎診斷的血清抗-HAV IgM、急性HBV感染的血清抗-HBc IgM和TORCH項目的系列IgM檢測等。目前，zui為常用的IgM抗體檢測方法為捕獲法，即以抗人IgM抗體（抗人μ鏈）作為固相抗體，當加入血清標本時，其中的IgM類抗體（特異的和非特異的）即可被固相抗體捕獲，再加入特異抗原，當其與固相上捕獲的IgM抗體結(jié)合后，加入酶標抗特異抗原的抗體，zui后加入底物顯色。具體操作步驟如下。
   （1）首先將抗人IgM μ鏈抗體于碳酸鹽緩沖液中2~8℃下一夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗體，洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不牢固的抗體后，用小牛血清或牛血清白蛋白或明膠等封閉，洗滌去除未結(jié)合的部份及雜質(zhì)。
   （2）加入含待測IgM抗體的臨床樣本如血清等，溫育（通常為37℃下）一定時間后，洗板；此時，待測樣本中的IgM抗體就會與固相上的抗μ鏈抗體反應而吸附于固相上。
   （3）加入特異的抗原如甲型肝炎病毒（hepatitis A virus, HAV）抗原、HBcAg等，溫育一定時間后，洗板；此時，特異抗原就會與固相上的特異IgM抗體發(fā)生反應。
   （4）加入酶標記的抗特異抗原的抗體，溫育一定時間后，洗板；此時，在固相上即形成相應的抗原抗體復合物；
  (5) 加入酶底物，溫育顯色測定。
采用上述模式要注意的是RF（IgM類）及其它非特異IgM的干擾。RF（IgM類）由于其能與固相抗人μ鏈抗體結(jié)合，并可與隨后加入的酶標抗體（動物IgG）反應，從而導致假陽性反應。而非特異IgM由于其在*步溫育中，可與特異IgM競爭與固相抗體結(jié)合，所以會影響測定的靈敏度。因此，使用本法測IgM，必須對臨床樣本進行適當稀釋。樣本稀釋后，上述產(chǎn)生干擾作用的非特異IgM含量減少，而特異IgM由于處于相應病原體的急性感染期，滴度很高，一定稀釋后，不會有明顯影響，況且，在某些病原體如HBV的慢性感染階段，IgM類特異抗體也能持續(xù)存在，只不過滴度要低很多。因此，如不對血清樣本稀釋，就直接檢測，即使是沒有非特異IgM的干擾，陽性測定結(jié)果也沒有急性感染的診斷價值。現(xiàn)在，有些試劑生產(chǎn)廠家，由于臨床實驗室減輕勞動強度、簡便操作的要求，生產(chǎn)了不需對樣本進行稀釋的抗-HAV IgM和抗-HBc IgM ELISA試劑盒，但用其檢測臨床標本得到的結(jié)果，很難具有急性感染診斷的價值。因此，我們建議臨床實驗室在做抗-HAV IgM和抗-HBc IgM等類檢測時，應使用對樣本進行稀釋的試劑盒，以保證檢測的臨床價值。